Nuove tecniche (versione completa riassuntiva)

Tizio Caio at Sempronio.it
Sun Sep 28 10:51:07 EST 2003


APPARECCHIO SINTESI PROTEINE E SCELTA MODALITA' DI AVVOLGIMENTO

L'apparecchio è costituito da recipienti nei quali sono presenti particelle
di resina, contenenti gli amminoacidi iniziali della catena, trattenute da
un filtro o fuse su una superficie tubolare esposta alla soluzione e nella
quale questa scorre. A ognuno di tali recipienti sono collegati i 20 tubi
che servono ad immettere le 20 soluzioni, ognuna delle quali contenente un
solo tipo di amminoacido, piu un'altro tubo per allontanare le soluzioni dal
recipiente, e un'altro tubo per immettere un liquido ad una determinata
temperatura avente lo scopo di rimuovere particolari molecole (A) legate
agli amminoacidi terminali delle proteine che si sta sintetizzando. Questa
particolare molecola (A), legata a una delle due estremità di ogni
amminoacido, ha lo scopo di impedire l'aggancio con un'ulteriore
amminoacido, ma essendo legata con deboli legami si stacca col calore, ad
una temperatura tale da non causare danni alla catena di amminoacidi. Un
programma per computer legge un file di testo e in base alle informazioni in
esso contenute viene determinato l'ordine di apertura e chiusura delle
valvole dei tubi che immettono le diverse soluzioni ad una determinata
temperatura. L'intera sequenza non viene montata in un solo recipiente,
l'apparecchio è costituito da numerosi recipienti in cui montare solo una
parte della sequenza di amminoacidi. Quando i frammenti della proteina,
ognuno dei quali composto da un determinato numero di amminoacidi verranno
completati e separati dalla resina, si aggiungerà ad una loro estremità una
molecola (A) che impedisce l'aggancio di ulteriori amminoacidi. Poi tali
frammenti verranno immessi automaticamente, uno per volta in un recipiente
in cui verrà montata la proteina completa, ma ad una temperatura tale da non
denaturare la struttura tridimensionale dei singoli frammenti. Quando il
primo frammento di proteina sarà legato all'amminoacido iniziale trattenuto
dalla resina, occorrerà poi far scorrere nel recipiente un liquido ad una
determinata temperatura avente lo scopo di rimuovere la particolare molecola
(A) legata all'ultimo amminoacido del frammento di proteina, in tal modo
diverrà possibile unire a tal frammento quello successivo. Affinche tale
sistema possa funzionare è necessario che la temperatura alla quale la
particolare molecola (A) si stacchi dall'amminoacido sia inferiore a quella
necessaria per denaturare le proteine, ma superiore a quella necessaria per
legare gli amminoacidi tra loro. Si scrive un file di testo in cui si
specifica la sequenza di amminoacidi della proteina che si vuole
sintetizzare; Con un determinato carattere della tastiera si specificano i
punti che delimitano i frammenti della proteina che verranno sintetizzati a
parte per poi essere usati per montare la proteina completa. Esempio: Le
abbreviazioni indicano gli amminoacidi della sequenza della proteina da
sintetizzare, il simbolo -X- serve a delimitare i frammenti da sintetizzare
a parte:

Phe-Leu-Ileu-X-Met-Val-Ser-Pro-X-Thr-Ala-Tyr-His-Glun-Aspn-Lys

Verranno sintetizzati a parte questi tre frammenti:
Phe-Leu-Ileu
Met-Val-Ser-Pro
Thr-Ala-Tyr-His-Glun-Aspn-Lys

E poi successivamente montati ad una temperatura tale da non denaturarne la
struttura tridimensionale, o tale da dispiegarne solo parzialmente la
catena; Per far ciò possono essere impiegati appropiati catalizzatori. E'
possibile miscelare alla resina una molecola (B) che consenta alla proteina
sintetizzata di staccarsi col calore senza dover solubilizzare la resina (se
si fonde col calore si denaturano le proteine). Ma la temperatura di
distacco dovrebbe essere inferiore a quella di denaturazione e superiore a
quella per staccare l'altra molecola (A) legata all'ultimo amminoacido della
catena. Temperature in ordine crescente, necessarie per:
1. Legare tra loro gli amminoacidi.
2. Staccare la molecola (A) legata all'ultimo amminoacido della catena.
3. Staccare, dalla molecola (B) miscelata alla resina, la proteina.
4. Denaturare completamente la proteina.
5. Staccare gli amminoacidi della proteina.


APPARECCHIO PER SINTESI DNA O RNA DA COMPUTER.

Una versione modificata dell'apparecchio su descritto, che immette
nucleotidi invece di amminoacidi, può permettere di sintetizzare velocemente
molecole di acidi nucleici, scrivendone la sequenza al computer, poi tali
molecole possono essere replicate con la PCR.



TECNICA DI AMPLIFICAZIONE PROTEINE

Come per i nucleotidi, anche gli amminoacidi hanno una parte della loro
molecola, in questo caso il "gruppo (R) variabile" che può essere
complementare al "gruppo (R) variabile" di un'altro amminoacido forse se
posto in posizione antiparallela. Quindi denaturando la proteina in
particolari condizioni di concentrazione amminoacidi e temperatura, fornendo
i 20 amminoacidi e forse anche l'appropiato enzima, sarebbe possibile
replicarla come avviene nella PCR. Occorre come per la PCR il "primer" un
breve frammento polipeptidico che si aggancierà, ad una determinata
temperatura, con i "gruppi (R) variabili" dei suoi amminoacidi a quelli
della proteina da replicare. Altro problema è che la temperatura alla quale
gli amminoacidi si legheranno al "primer" potrebbe non coincidere con la
temperatura di denaturazione della proteina. Quindi potrebbe essere
necessario far coincidere tali temperature utilizzando appropiati
catalizzatori. Vi è la possibilità che alcuni dei 20 amminoacidi possano
essere complementari e quindi legarsi a più di un tipo di amminoacido; In
tal caso occorre sintetizzare degli amminoacidi più selettivi; Esempio:
Immaginiamo che l'amminoacido (A) possa legarsi sia con l'amminoacido (B)
che non l'amminoacido (C), in tal caso occorrerà sintetizzare due
amminoacidi artificiali modificando la struttura dell'amminoacido (A) in
modo da renderlo in grado di legarsi solo l'amminoacido (B) ma non con (C),
e poi sintetizzarne un'altro in grado di legarsi solo l'amminoacido (C) ma
non con (B). Avremo così a disposizione un gruppo di amminoacidi (tra cui
alcuni modificati) ognuno dei quali capace di legarsi ad un solo altro
amminoacido complementare.
Diventa così possibile con un procedimento simile alla PCR ottenere, prima
una proteina (B) costituita esclusivamente da amminoacidi più selettivi,
complementare alla proteina (A) da amplificare, poi replicare la proteina
(B) ottenendone un gran numero di copie, e infine, usando una soluzione
contenente amminoacidi normali, assemblare la proteina (A) originaria,
usando la proteina (B) come stampo.


APPARECCHIO PER IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA

Si miscela a della resina, dei brevi frammenti di DNA aventi una molecola di
didesossinucleosidetrifosfato (ddNTP) legata all'estremità 3' di ciascuno
dei due filamenti di cui i frammenti sono composti. Ad una determinata
temperatura il DNA da sequenziare dovrebbe legarsi ai brevi frammenti di DNA
fissati e sporgenti dalla superficie della resina, ma solo con la loro
estremità 3' all'estremità 5' del frammento di DNA nella resina. Si esegue
la fase di denaturazione della PCR per staccare i filamenti di DNA
complementari che verranno allontanati. Se la molecola di ddNTP è legata con
deboli legami alla catena di nucleotidi, si puo rimuoverla con la
temperatura senza danneggiare il filamento di DNA, altrimenti occorre
sintetizzare molecole simili a quella su citata ma che si leghino per mezzo
di deboli legami. Rimangono così solo i singoli filamenti dei frammenti di
DNA da sequenziare, legati con la loro estremità 3' ai frammenti di DNA
(dotati di entrambi i filamenti) trattenuti e sporgenti dalla resina.
Siccome il DNA da sequenziare ha sia due estremità 3' che due estremità 5',
si saranno ottenuti due diversi filamenti attaccati con la loro estremità 3'
al frammento nella resina. Si fa avvenire la terza fase della PCR, la
polimerizzazione, ma immettendo nel recipiente soluzioni contenenti un solo
tipo dei quattro ddNTP. Si provano uno per volta, quando il sensore rileva i
fotoni emessi dalla reazione vuol dire che il ddNTP usato si è legato a uno
dei due filamenti di DNA oppure a tutti e due, in tal caso si immettono uno
per volta le soluzioni contententi uno dei quattro tipi di nucleotidi
normali. Se il sensore non rileva i fotoni emessi dalla reazione per nessuno
dei quattro nucleotidi normali, vuol dire che il tipo di ddNTP si era legato
ad entrambi i filamenti, in tal caso si ripete il tutto dall'inizio ma prima
di provare i ddNTP si aggiunge il nucleotide normale che andrà a legarsi ad
entrambi i filamenti. Se invece il sensore rileva i fotoni vuol dire che il
ddNTP si era legato ad uno solo dei due filamenti, le reazioni possono
quindi pocedere solo sull'altro filamento. Ora è possibile con l'apparecchio
sotto descritto eseguire il sequenziamento del DNA.

Si fa avvenire la terza fase della PCR in un piccolo recipiente a cui sono
collegati quattro paia di tubi, ognuno dei quattro paia serve a far scorrere
nel recipiente una soluzione contenente un solo tipo di nucleotide. Con
ritmo regolare vengono fatti fluire da tali tubi uno solo alla volta ognuna
delle quattro soluzioni. Nel recipiente sono contenuti numerosi filamenti di
DNA i cui nucleotidi iniziali sono legati a particelle di resina trattenute
da un filtro o fuse su una superficie tubolare esposta alla soluzione e
nella quale questa scorre. Su è descritto il procedimento per ottenere i
singoli filamenti dei frammenti di DNA da sequenziare, legati con la loro
estremità 3' a frammenti di DNA (dotati di entrambi i filamenti) trattenuti
e sporgenti dalla resina, quindi i primer non sono necessari. Quando i
nucleotidi di un solo tipo si legano al DNA, i sensori nel piccolo
recipiente registrano i fotoni emessi dalla reazione o variazioni di
temperatura. In base a quali tubi erano aperti, e quindi quale dei quattro
nucleotidi era in soluzione, nel momento che i sensori rilevano che è
avvenuta una reazione, è possibile stabilire quale dei quattro nucleotidi si
è legato alla catena di DNA. Un computer memorizza in un file i segnali
elettrici provenienti dai sensori e dallo stato delle valvole (aperte o
chiuse). Se si attaccano due o più nucleotidi dello stesso tipo in
successione nella catena, vi dovrebbe essere una differenza (una doppia o
tripla quantità di fotoni) che i sensori sono in grado di rilevare e
tradurre (come segnale elettrico) in due o piu nucleotidi dello stesso tipo
invece di uno.



APPARECCHIO PER IL SEQUENZIAMENTO DELLE PROTEINE

Questo apparecchio sfrutta la "Tecnica di amplificazione proteine" (su
descritta) e si basa sullo stesso principio di funzionamento
dell'apparecchio per il sequenziamento del DNA (sopra descritto), con la
sola differenza che vengono immessi amminoacidi invece di nucleotidi; Quindi
verrà quì descritta solo la fase di preparazione e questa nota: La
temperatura deve essere tale da permettere ad un amminoacido di legarsi con
il suo "gruppo (R) variabile" al "gruppo (R) variabile" dell'amminoacido
della proteina ancorata alla resina, solo se tal amminoacido può legarsi
anche con la sua estremità carbossilica all'estremità amminica del
polipeptide complementare (e si ipotizza in posizione antiparallela) alla
proteina da sequenziare.

FASE1: Della resina viene miscelata a delle particolari molecole ognuna
delle quali costituita da due brevi frammenti polipeptidici; Gli amminoacidi
di un polipeptide hanno agganciati ai loro "gruppi (R) variabili" i gruppi
(R) variabili degli amminoacidi dell'altro frammento polipeptidico
perfettamente complementare. Questi frammenti serviranno per fissare alla
resina la proteina da sequenziare, e forniranno il "primer", necessario ad
innescare la reazione, che si troverà già legato all'estremità iniziale
della catena. FASE2: Ad una determinata temperatura la proteina da
sequenziare dovrebbe legarsi ai brevi frammenti polipeptidici fissati e
sporgenti dalla superficie della resina. Siccome in una proteina gli
amminoacidi sono uniti tra loro con legami peptidici, che si formano tra il
gruppo amminico e il gruppo carbossilico di due amminoacidi adiacenti, ne
consegue che una proteina ha due estremità: l'estremità amminica e
l'estremità carbossilica. Siccome le molecole fissate e sporgenti dalla
superficie della resina, sono costituite da due brevi frammenti
polipeptidici complementari, agganciati tra loro con i "gruppi (R)
variabili" dei loro amminoacidi, ne consegue che ognuna di tali molecole,
avrà 4 estremità: due estremità amminiche e due estremità carbossiliche. C'è
una molecola legata all'estremità amminica di ciascuno dei due frammenti
polipeptidici di cui sono composte le molecole fissate e sporgenti dalla
superficie della resina, che impedisce ad ulteriori amminoacidi di legarsi a
tali estremita, in modo che le proteine da sequenziare possano legarsi solo
con la loro estremità amminica all'estremità carbossilica del polipeptide
sporgente dalla resina (Questo se i due frammenti polipeptidici, di cui sono
composte le molecole nella resina, sono tra loro antiparalleli, altrimenti
si può procedere in diverso modo). In questo caso si è scelto di unire la
proteina con la sua estremità amminica al frammento nella resina ma non sò
con quale delle due estremità la proteina debba legarsi affinchè il
procedimento funzioni, quella amminica oppure carbossilica. FASE3: La
molecola legata all'estremità amminica di ciascuno dei due frammenti
polipeptidici di cui sono composte le molecole fissate e sporgenti dalla
superficie della resina, che impedisce ad ulteriori amminoacidi di legarsi a
tali estremita, è costituita in modo tale da legarsi all'estremità amminica
con deboli legami in modo che possa essere rimossa col calore, ad una
temperatura tale da non danneggiare la catena polipeptidica. La temperatura
necessaria per staccare tale molecola può essere superiore a quella
necessaria per separare i due frammenti polipeptidici complementari,
agganciati tra loro con i "gruppi (R) variabili" dei loro amminoacidi, ma la
resina, solida a quella temperatura trattiene i due filamenti nel tratto
iniziale con cui sono ad essa fissati. Rimangono così solo le proteine da
sequenziare legate con le loro estremità amminiche alle estremità
carbossiliche delle molecole, fissate e sporgenti dalla superficie della
resina, costituite da due frammenti polipeptidici complementari, agganciati
tra loro con i "gruppi (R) variabili" dei loro amminoacidi. Ora è possibile
con tale apparecchio eseguire il sequenziamento della proteina.






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