Protein purification

[Jose M. Bautista]

On 21 Mar 1996, Inmaculada Garcia wrote:

>  I have just tried to purify one protein from a SDS-PAGE gel, I cut one 
> band of around 25 KDa, then I followed one protocol from AMICON, that 
> includes a filtering step to remove the gel, and then after concentration 
> of the sample I loaded it again to see the results. I have seen that the 
> protein has become now bigger, around 60 KDa or more, does anyone have 
> any idea if this is a kind of aggregation? and how it happens?
> 
>  Thanks in advance (could you mail me to garciai at uv.es?)
> 
>     Inmaculada Garcia Robles
> 
> 
> 
Inmaculada,

la agregacion te podria pasar si en el paso de filtracion no tenias 
mercaptoetanol y se produjesen puentes disulfuro entre cysteinas (tiene 
tu proteina Cys?), aunque en principio cuando la volvieses a cargar en un 
gel nuevo de SDS con buffer de la muestra conteniendo mercaptoethanol la 
agregacion desapareceria si has hervido bien la muestra antes de 
cargarla. Adicionalmente se me ocurren otras dos posibilidades:
1) Que si has corrido en diferentes condiciones de acrilamida en el 
segundo gel los marcadores han podido correr algo diferente y parece que 
tiene 60kDa.
2) Algun tipo de agregacion especifica si esta proteina forma por ejemplo 
dimeros en la forma nativa, y por lo que sea no se han podido destruir 
tras hervir la muestra.

En cualquier caso es raro que se te forme una sola banda de 60kDa si la 
agregacion es inespecifica. Usualmente en este tipo de agregaciones 
aparecen especies de varios pesos moleculares.

Mira la secuencia o la estructura tridimensional de la proteina, quizas 
te ayude a saber que pasa especificamente.

Suerte

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