IUBio GIL .. BIOSCI/Bionet News .. Biosequences .. Software .. FTP

<!doctype html public "-//w3c//dtd html 4.0 transitional//en">
<html>
Hej Dustin,
<p>try this, relatively cheap and non radioactive, ...works.
<p>good luck
<br>&nbsp;
<p>Regulation of phosphotransferase activity of hexokinase 2 from Saccharomyces
cerevisiae by modification at serine-14
<br>Golbik R, Naumann M, Otto A, Muller EC, Behlke J, Reuter R, Hubner
G, Kriegel TM
<br>BIOCHEMISTRY : 40 (4): 1083-1090 JAN 30 2001
<p>Abstract:
<br>Isoenzyme 2 of hexokinase functions in sugar sensing and glucose repression
in Saccharomyces cerevisiae, The degree of in
<br>vivo phosphorylation of hexokinase 2 at serine-14 is inversely related
to the extracellular glucose concentration [Vojtek, A. B.,
<br>and Fraenkel, D. G. (1990) fur. J, Biochem. 190, 371-375]; however,
a physiological role of the modification causing the
<br>dissociation of the dimeric enzyme in vitro [as effected by a serine-glutamate
exchange at position 14; Behlke et al. (1998)
<br>Biochemistry 37, 11989-11995] is unclear. This paper describes a comparative
stopped-flow kinetic and sedimentation
<br>equilibrium analysis performed with native unphosphorylated hexokinase
2 and a permanently pseudophosphorylated
<br>glutamate-14 mutant enzyme to determine the functional consequences
of phosphorylation-induced enzyme dissociation, The
<br>use of a dye-linked hexokinase assay monitoring proton generation allowed
the investigation of the kinetics of glucose
<br>phosphorylation over a wide range of enzyme concentrations. The kinetic
data indicated that monomeric hexokinase represents
<br>the high-affinity form of isoenzyme 2 for both glycolytic substrates.
Inhibition of glucose phosphorylation by ATP [Moreno et
<br>al, (1986) Eur, J, Biochem. 161, 565-569] was only observed at a low
enzyme concentration, whereas no inhibition was
<br>detected at the high concentration of hexokinase 2 presumed to occur
in the cell. Pseudophosphorylation by glutamate
<br>substitution for serine-14 increased substrate affinity at high enzyme
concentration and stimulated the autophosphorylation of
<br>isoenzyme 2, The possible role of hexokinase 2 in vivo phosphorylation
at serine-14 in glucose signaling is discussed.
<p>dustjohn@hotmail.com wrote:
<blockquote TYPE=CITE>I am in need of a decent protocol to measure ATP
hydrolysis in solution.&nbsp; One way to do it is to hydrolyze radioactive
ATP (cleave off the gamma-32P), use charcoal and TCA to remove protein/ATP/ADP
and then scintillation count an aliquot of the supernatant.&nbsp; However
this method is not the greatest because there are high background levels
of 32PPi in the supernatant if the ATP solution is not pure.&nbsp; Does
anybody have any suggestions as to what I should do?&nbsp; Are there any
relatively cheap non-radioactive ATPase assays?&nbsp; Any ideas of a good
positive control (I'm working with a Ser/Thr protein kinase so any enzyme
along this line would be fantastic).
<p>Thanks for your help!
<p>Dustin
<p><a href="http://biowww.net/mynews/tree.php?group_name=bionet_molbio_proteins&begin=0">http://biowww.net/mynews/tree.php?group_name=bionet_molbio_proteins&amp;begin=0</a></blockquote>
</html>

Send comments to us at archive@iubio.bio.indiana.edu