Christian Radauer wrote:
>> Hi all,
>> I am trying to express a single chain T cell receptor (i.e. my insert
> consists of alpha-chain/linker/beta-chain; together about 700 bases) in
> sf9 insect cells using the baculovirus expression system obtained from
> Pharmingen. My vector (pAcSecG2T) is designed to enable the protein to be
> secreted into the medium. I found the protein (via western blot) in the
> cell lysate (the molecular weight was correct) but not in the cell
> culture supernatant.It seems as if the protein plus leader got stuck in
> the ER due to wrong folding. Has anyone of you who works with the baculo
> expression system and tries to express heterodimers like antibodies,TCR`s,
> MHC`s,...(as single-chains or alpha and beta-chain separately) ever
> encountered a problem like this and what did you do to overcome it? I am
> eagerly awaiting some helpful hints to solve my problem.
>> thanks,
> Christian
> -------------------------------------------------------
> Christian Radauer
> Institute of General and Experimental Pathology
> University of Vienna
>> AKH 3Q Phone: +43 (1) 40400 5116
> Waehringer Guertel 18-20 FAX: +43 (1) 40400 5130
> A-1090 Wien
> Austria
>> e-mail: rc150295 at emb1.bcc.univie.ac.at> -------------------------------------------------------Hallo Christian,
ich habe Dein Problem gelesen und kann dir zwar nicht besonders
weiterhelfen, aber kann Dir zumindest mitteilen, dass ich den gleichen
Vektor im Bacculovirussystem angewendet habe. Ich habe versucht den
extrazellulaeren Teil eines Lymphozytenrezeptors zu exprimieren und ins
Medium exportieren zu lassen. Ich hatte auch grosse Proteinmengen im
Lysat, aber nichts im Ueberstand. Bei mir war wohl das Problem, dass die
Bildung von inclusion bodies die Sekretion verhinderte. Ich konnte aber
im weiteren Verlauf funktionelles Protein aus den inclusion bodies
aufreinigen. Wenn Dich das interessiert kannst du es mir ja mitteilen.
Viel Glueck,
Joachim
